什么是ChIP檢測？

染色質(zhì)免疫共沉淀 (ChIP, Chromatin immunoprecipitation)，是一種反映活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)-DNA 相互作用的方法。蛋白質(zhì)-DNA 復(fù)合物交聯(lián)固定后，將染色質(zhì)隨機(jī)打斷成片段，利用免疫學(xué)方法，將帶有目標(biāo)蛋白的復(fù)合物特異性地沉淀、富集下來，通過對復(fù)合物中 DNA 片段的純化與檢測，可以獲得蛋白質(zhì)與 DNA 相互作用的信息。一些非常穩(wěn)定的相互作用則不需要交聯(lián)。

ChIP 與其它方法結(jié)合，擴(kuò)大了其應(yīng)用范圍。與實時熒光定量 PCR 結(jié)合的 ChIP-qPCR，常用于檢測蛋白質(zhì)與特定位點的 DNA 是否有結(jié)合及結(jié)合的強(qiáng)度；與基因芯片結(jié)合的 ChIP-on-chip，廣泛應(yīng)用于特定靶標(biāo)的高通量篩選；與高通量測序結(jié)合的 ChIP-seq，越來越多地被用于分析目標(biāo)蛋白的全基因組結(jié)合情況。

交聯(lián)染色質(zhì)免疫共沉淀 (Crosslinked ChIP, XChIP)
需要交聯(lián)固定，一般使用甲醛，適用于結(jié)合力較弱的蛋白質(zhì)- DNA 相互作用的研究。

自然染色質(zhì)免疫共沉淀 (Native ChIP, NChIP)
不需要交聯(lián)固定，適用于結(jié)合穩(wěn)定的蛋白質(zhì)- DNA 相互作用（如組蛋白修飾）的研究。

圖1. XChIP 與 NChIP 的流程概述 (王泓力 & 焦雨鈴., 植物學(xué)報, 2020^[1])


優(yōu)勢
XChIP 在活細(xì)胞狀態(tài)下就將蛋白質(zhì)與 DNA 固定，更真實地反應(yīng)二者之間結(jié)合的情況，比體外研究蛋白質(zhì)-DNA 相互作用的方法更好。
與其它方法的靈活結(jié)合，可以分析蛋白質(zhì)-DNA 相互作用的強(qiáng)度，還能夠得到目標(biāo)蛋白在全基因組上的所有結(jié)合信息。

文獻(xiàn)
2020 年，Molecular Cell 雜志發(fā)表的研究論文 Opposing Functions of BRD4 Isoforms in Breast Cancer^[2].

1. 文獻(xiàn)主要結(jié)論
BRD4 (Bromodomain-containing protein 4) 蛋白是正在進(jìn)行的臨床試驗中癌癥治療靶點之一，文章使用 RNA-seq, ChIP-qPCR, ChIP-seq, 和 CUT&RUN 等方法證實在乳腺癌中，BRD4 短亞型 (BRD4-S) 是致癌的；而 BRD4 長亞型 (BRD4-L) 則具有相反的作用，能夠抑制腫瘤形成和轉(zhuǎn)移。并進(jìn)一步確認(rèn) EN1 (Engrailed-1) homeobox 轉(zhuǎn)錄因子是關(guān)鍵的 BRD4-S 共調(diào)節(jié)因子，尤其表現(xiàn)在三陰性乳腺癌中。BRD4-S 和 EN1 通過調(diào)節(jié)癌癥相關(guān)基因和通路的增強(qiáng)子，以共同調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì) (ECM) 相關(guān)的網(wǎng)絡(luò)。因此，文章強(qiáng)調(diào)了針對 BRD4 的靶向治療應(yīng)該更加特異性地針對 BRD4-S 的致癌活性而不是抑癌活性。

2. 研究結(jié)果
針對乳腺癌中 BRD4 不同亞型的抗體設(shè)計及其表達(dá)豐度檢測

圖2. BRD4 結(jié)構(gòu)域組成的圖示與所設(shè)計抗體的靶向位點(a)，TCGA 公共數(shù)據(jù)庫中乳腺癌患者組織內(nèi) BRD4 亞型的 mRNA 表達(dá)水平(b)

體內(nèi)實驗探究 BRD4-S 與 BRD4-L 的作用

圖3. 小鼠體內(nèi)實驗驗證 BRD4-S 具有促進(jìn)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的作用，而 BRD4-L 則相反

ChIP-qPCR 實驗驗證目標(biāo)蛋白與目標(biāo) DNA 區(qū)域的結(jié)合

圖4. ChIP-qPCR 實驗驗證 BRD4 的不同亞型與 EN1 結(jié)合位點的相互作用；以及 EN1, BRD4-S, BRD4-L, 重要組蛋白修飾, dCas9-KRAB 之間的聯(lián)系，提出了通路模型。

ChIP-seq 實驗在全基因組范圍內(nèi)描述 BRD4 與 EN1 的相互作用

圖5. 全基因組 ChIP-seq 分析 BRD4 不同亞型與 EN1 在啟動子，增強(qiáng)子等區(qū)域的結(jié)合，以及它們的共同結(jié)合位點


文章通過結(jié)合 RNA-seq，ChIP-qPCR，ChIP-seq 等實驗方法，檢測了正常上皮細(xì)胞和不同乳腺癌中的內(nèi)源性 BRD4 蛋白亞型，發(fā)現(xiàn) BRD4-S 和 BRD4-L 在乳腺腫瘤進(jìn)展期間各自具有獨(dú)特甚至相反的生物學(xué)功能作用。BRD4-S 促進(jìn)癌細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移；相反，BRD4-L 抑制腫瘤進(jìn)展并限制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移到某些器官/組織的轉(zhuǎn)移潛能，部分是因為它在生長因子誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移和腫瘤干細(xì)胞的增殖中表現(xiàn)出抑制作用。BRD4-S 與 EN1 相互作用，以激活 ECM 相關(guān)的基質(zhì)網(wǎng)絡(luò)，從而為腫瘤進(jìn)展提供適當(dāng)?shù)哪[瘤微環(huán)境。


ChIP是一種穩(wěn)定，可靠，應(yīng)用十分普遍的鑒定活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)-DNA相互作用的方法，不僅適用于基因組上特定位點的檢測，也適用于全基因組范圍的描述，還可以用于大量樣本的高通量檢測�？梢詮V泛應(yīng)用于細(xì)胞內(nèi)新通路的篩選和鑒定，以及新機(jī)制的發(fā)現(xiàn)。


參考文獻(xiàn)
[1] 王泓力, & 焦雨鈴. (2020). 染色質(zhì)免疫共沉淀實驗方法. 植物學(xué)報(4).
[2] Wu, S. Y. , Lee, C. F. , Lai, H. T. , Yu, C. T. , & Chiang, C. M. . (2020). Opposing functions of brd4 isoforms in breast cancer. Molecular Cell, 78(6).

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