流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期:
細(xì)胞周期:指細(xì)胞從前一次分裂結(jié)束起到下一次分裂結(jié)束為止的活動過程,通常由G0/G1期、S期、G2期和M期組成。G0/G1期:有絲分裂發(fā)生,細(xì)胞分裂成兩個細(xì)胞,進(jìn)入下一個細(xì)胞周期,或者進(jìn)入靜止期(G0期),而G0期從DNA含量上無法與G1期區(qū)分,細(xì)胞開始RNA和蛋白質(zhì)的合成,但DNA含量仍保持二倍體。S期:DNA開始合成,細(xì)胞核內(nèi)DNA的含量介于G1期和G2期之間。G2期和M期:當(dāng)DNA復(fù)制成為4倍體時,細(xì)胞進(jìn)入G2期。G2期細(xì)胞繼續(xù)合成RNA及蛋白質(zhì),直到進(jìn)入M期。
PI法是經(jīng)典的周期檢測方法。PI為插入性核酸熒光染料,能選擇性的嵌入核酸DNA和RNA雙鏈螺旋的堿基之間與之結(jié)合,其結(jié)合的量與DNA的含量成正比例關(guān)系,用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析,就可以得到細(xì)胞周期各個階段的DNA分布狀態(tài),從而計算出各個期的百分含量。
一般流程:細(xì)胞收集-70%酒精固定過夜-PI染色-流式細(xì)胞儀檢測。
細(xì)胞凋亡:細(xì)胞凋亡的早期就有細(xì)胞膜表面破損發(fā)生。破損時凋亡細(xì)胞表面的磷脂腺絲氨酸(PS)可以從細(xì)胞內(nèi)膜翻轉(zhuǎn)至細(xì)胞的外膜。該過程發(fā)生在DNA片段化之前,因而檢測PS的表達(dá),能反映早期凋亡。AnnexinV是Ca2+依賴的磷脂結(jié)合蛋白,對PS有很高的親和性,并且可以與暴露于細(xì)胞外的PS相結(jié)合。利用這一原理,可以將AnnexinV標(biāo)記熒光來識別早期的細(xì)胞凋亡。通常利用AnnexinV-FITC和碘化丙啶(PI)來區(qū)分凋亡和壞死細(xì)胞。PI的膜通透性很差,因而只能標(biāo)記壞死的細(xì)胞。
一般流程:細(xì)胞收集-PI-AnnexinV標(biāo)記-流式細(xì)胞儀檢測。
結(jié)果示例:
圖 A 細(xì)胞周期檢測圖;B 細(xì)胞凋亡檢測圖